Kozmetik Ürünlerde Koruyucu Etkinliğinin Belirlenmesi için Kullanılan Test Yöntemlerinin Karşılaştırılması

Bu yazımızda, kozmetik ürün formülasyonunda yer alan koruyucunun, etkinliğinin değerlendirilmesi için kullanılan farklı test yöntemlerinin birbirlerine göre üstünlük ve farklılıklarının değerlendirmesini bulabilirsiniz.

Koruyucu Nedir?

Koruyucular, mikroorganizmaları öldüren ya da büyümesini durduran kimyasal ajanlardır.

Kozmetik Yönetmeliği’nde ise “Tek veya temel olarak mikroorganizmaların kozmetik üründe gelişmesini engellemeyi amaçlayan maddeler” şeklinde tanımlanmıştır.

Koruyucuların Kullanım Amacı Nedir?

Koruyucuların kullanım amacı bitmiş ürün açısından değerlendirildiğinde formülasyona eklenen koruyucu, üründe gözle görülen mikrobiyal büyümenin ve ürünün kokusunda, viskozitesinde ve renginde oluşabilecek değişimlerin önlenmesi içindir.

Tüketici açısından değerlendirildiğinde ise formülasyona eklenen koruyucu, oluşabilecek enfeksiyonun önlenmesi içindir. Olası bir enfeksiyon ciddi sonuçlar doğurabilir. Örneğin; gözlerde meydana gelen enfeksiyon körlüğe neden olabilir, açık yara ya da kesik varsa septisemi oluşabilir, hatta bağışıklık sistemi zayıf tüketicilerde ölümle sonuçlanabilir.

En çok kullanılan klasik koruyucular aşağıdaki şekilde özetlenebilir;

• Parabenler (ör. metil paraben, propil paraben)
• Formaldehit türevleri (ör. DMDM Hidantoin)
• İzotiyazolinonlar (ör. MCT, MIT)
• Fenolik bileşikler (ör. fenoksietanol)
• Asitler (ör. sorbik asit, benzoik asit)
• Halojenli bileşikler (ör. klorfenesin)
• Alkoller (ör. etil alkol)
• Kuaterner amonyum tuzları (örn. benzalkonyum klorür)

Kullanılan alternatif koruyucular ise aşağıdaki şekilde özetlenebilir;

Başka fonksiyonları için kullanılan ve klasik koruyucularla kombine edilebilen ve klasik koruyucuların etkinliğini artıran bileşiklerdir. Bu bileşikler izin verilen koruyucular listesinde yer almaz. Örneğin; kekik yağı.

Koruyucu etkinlik testi neden yapılır?

Koruyucu etkinlik testi bir formülasyon içindeki koruyucunun seçilmiş mikroorganizmalara karşı etkinliğinin saptanması için yapılan testtir.

Genel olarak test aşamaları nelerdir?

Standardize edilmiş mikrobiyal süspansiyonun ürüne inokule edilmesi, belli aralıklarla 1 g’lık kısımların alınması, koruyucunun antimikrobiyal aktivitesinin nötralize edilmesi, mikroorganizmaların geri kazanılması, logaritmik azalmanın hesaplanması şeklindedir.

Koruyucu etkinlik testi farklı metotlar ile gerçekleştirilebilir, bunlardan bazıları:

• Farmakope Metotları;
• USP Antimikrobiyal Etkinlik Testi
• BP/EP Antimikrobiyal Korumanın Etkinliği Testi
• JP Koruyucu Etkinlik Testi
• Kuruluşların Metotları;
• CTFA (PCPC) 5 tip koruyucu etkinlik testi
• ASTM E640-78 Su içeren kozmetiklerde kullanılan koruyucular için standart metod
• Standart Koruyucu Etkinlik Test Metotları;
• AOAC 998.10 Koruyucu Etkinlik Testi (Göz Çevresinde Kullanılmayan Su ile Karışabilen Ürünler için)
• ISO 11930 Kozmetik Ürünlerde Koruyucu Etkinliğinin Değerlendirilmesi
• Dahili Koruyucu Etkinlik Test Metotları
• Schülke KoKo test
• Diğer Koruyucu Etkinlik Test Metotları
• Doğrusal Regrasyon Metodu, Membran Filtrasyon Metodu, Toz Farlar için PET Metodu
• CTFA Koruyucu Etkinlik Test Metodu

Koruyucu Etkinlik Testleri arasındaki temel farklar nelerdir?

• Test mikroorganizmalarının farklı olması
• İnokulum hazırlanmasının farklı olması
• İnokülasyon miktarının farklı olması
• İnokülasyon sonrası numune alma zamanının farklı olması
• Kabul kriterleri arasındaki farklar
• Koruyucu stabilitesi arasındaki farklar

Test Mikroorganizmalarının Farklı Olması

Yöntemlere göre test mikroorganizmaları açısından farklılıklar aşağıdaki tablo ile özetlenmiştir.

	Ph. Eur. 7	USP ˂51˃	Schülke KoKo Test	ISO 11930
BAKTERİLER
Enterobacter gergoviae			+
Escherichia coli	(+)	+	+	+
Klebsiella pneumoniae			+
Kocuria rhizophila			+
Pseudomonas aeruginosa	+	+	+	+
Pseudomonas fluorescens			+
Pseudomonas putida			+
Staphylococcus aureus	+	+	+	+
MAYALAR
Candida Albicans	+	+	+	+
KÜFLER
Aspergillus brasiliensis	+	+	+	+
Penicillium pinophilum			+
Penicillium türleri			+
Zygosaccharomyces rouxii	(+)
Kozmetik ürünlerin bozulmasına yol açtığı bilinen özel mikroorganizmalar	(+)
AÇIKLAMA      +  kullanılması zorunlu olan      (+) opsiyonel

İnokulum Hazırlanmasının Farklı Olması

Bu aşamada mikroorganizmalar besi ortamından alınılarak seyreltilir. Eğer mikroorganizmalar karışım halinde kullanılacak ise öncesinde maksimum 3 gün buzdolabında saklanmalıdır. ISO 11930 metodunda suşlar ayrı ayrı kullanılmalıdır, ancak KoKo test metodunda karışık kültür süspansiyonu kullanılır.

İnokülasyon Miktarının Farklı Olması

Yöntemlere göre inokülasyon miktarı açısından farklılıklar aşağıdaki tablo ile özetlenmiştir.

Metodlar	Numune Miktarı	İnokül Miktarı	İnokül Mikroorganizma Sayısı	Kozmetik Üründeki Mikroorganizma Sayısı
ISO 11930	20 g 20 ml	1%	107-108 kob/ml bakteri106-107 kob/ml mantar	105-106 kob/ml bakteri104-105 kob/ml mantar
Schülke KoKo Test	25 g	%0,4 her inokülasyon için (%2,4 toplam 6 inokülasyonda)	107-108 kob/ml bakteri106-107 kob/ml mantar	4×104-4×105 kob/ml bakteri her bir inokülasyon için2,4×105-2,4×106 kob/ml bakteri toplam 6 inokülasyonda4x103-4×104 kob/ml mantar her bir inokülasyon için2,4×104-2,4×105 kob/ml mantar toplam 6 inokülasyonda
Ph. Eur 7	Orijinal Ambalaj	≤ %1	~ 108 kob/m	105-106 kob/ml
USP ˂51˃	Orijinal Ambalaj	% 0,5 – 1,0	~ 108 kob/m	105-106 kob/ml

İnokülasyon Sonrası Numune Alma Zamanının Farklı Olması

Yöntemlere göre inokülasyon sonrası numune alma zamanları açısından farklılıklar aşağıdaki tablo ile özetlenmiştir.

Metot	2. Gün	7. Gün	14. Gün	21. Gün	28. Gün	35. Gün	42. Gün
Ph. Eur. 7	x	x	x	–	x	–	–
USP <51>	–	–	x	–	x	–	–
Schülke KoKo Test	–	x	x	x	x	x	x
ISO 11930	–	x	x	–	x	–	–
Sayım Yapılan Günler: x

Kabul Kriterleri Arasındaki Farklar

Yöntemlere göre kabul kriterleri açısından farklılıklar aşağıdaki tablo ile özetlenmiştir.

Tür	Kriter	Log Azalımı
2. Gün	7. Gün	14. Gün	21. Gün	28. Gün	35. Gün	42. Gün
Bakteri	Ph. Eur. 7	A	≥2	≥3	–	–	NI	–	–
B	–	–	≥3	–	NI	–	–
USP <51>	–	–	≥2	–	NI	–	–
Schülke KoKo Test	A	–	≥4	≥4	≥4	≥4	≥4	≥4
B	–	≥3	≥3	≥3	≥3	≥3	≥3
ISO 11930	A	–	≥3	NI	–	NI	–	–
B	–	–	≥3	–	NI	–	–
Mantar	Ph. Eur. 7	A	–	–	≥2	–	NI	–	–
B	–	–	≥1	–	NI	–	–
USP <51>	–	–	NI	–	NI	–	–
Schülke KoKo Test	A	–	≥3	≥3	≥3	≥3	≥3	≥3
B	–	≥2	≥2	≥2	≥2	≥2	≥2
Maya	ISO 11930	A	–	≥1	NI	–	NI	–	–
B	–	–	≥1	–	NI	–	–
Küf	ISO 11930	A	–	–	≥0	–	≥1	–	–
B	–	–	≥0	–	NI	–	–
NI: Artış yok

• ISO 11930

Eğer formülasyon Kriter A’yı karşılayabiliyor ise mikrobiyal riskin göz ardı edilebileceği ve kozmetik ürünün Uluslararası Standartları karşıladığı düşünülür.

Eğer formülasyon Kriter B’yi karşılıyor ise mikrobiyolojik riskin formülasyonla ilgili olmadığını gösterir. Örneğin pompalı bir ambalajda ürünü muhafaza etmek kavanoza göre uygun olabilir.

• Schülke KoKo Test

Yapılan 6 inokülasyon sonrası Kriter A’nın karşılanmış olması ürünün iyi korunduğunu gösterir. Kriter B’nin karşılanması ISO 11930’da olduğu gibi mikrobiyolojik riskin formülasyonla ilgili olmadığını gösterir. Örneğin pompalı bir ambalajda ürünü muhafaza etmek kavanoza göre uygun olabilir.

• Eur. 7

Kriter A’nın karşılanmış olması elde edilmiş olan etkinliği gösterir. A kriterinin karşılanamadığı durumlarda Kriter B karşılanmalıdır.

Koruyucu Stabilitesi Arasındaki Farklar

Metotlar	Koruyucu Stabilitesi
USP <51>	Stabilite hakkında bir bilgi sunmaz ancak; test üretici tarafından sunulan son ambalajda yapıldığını belirtir.
Ph. Eur. 7	Test ürünün nihai kabında gerçekleştirildiği için depolama süresinde ürünün korunmasıyla ilgili fikir sunar.
Schülke KoKo Test	6 kez inokülasyon yapılması koruyucu stabilitesinin kontrolünü sağlar
ISO 11930	Koruyucunun stabilitesi hakkında bir bilgi bulunmamaktadır.

SCCS’ye göre kozmetik bir ürünün raf ömrü boyunca güvenli bir şekilde muhafaza edildiğini anlayabilmek için tek bir inokülasyon yeterli değildir. Aktiflerin bozulması veya pH’ın değişimiyle inaktif hale gelmeleri durumları göz önünde bulundurulmalıdır.

Metotlar arasındaki tüm bu benzerlik ve farklılıklar karşılaştırıldığında en çeşitli test mikroorganizması içeren yöntem Schülke Koko Test’tir. ISO 11930 metodunda kullanılan test mikroorganizmaları farmakope yöntemlerindekilerden fazladır. Test mikroorganizmaları açısından en katı yöntem Scülke KoKo Test’tir.

ISO 11930 yönteminde suşların ayrı ayrı kullanılması avantajdır. KoKo Test metodunda karışık kültür süspansiyonu kullanılmaktadır.

ISO 11930 yöntemindeki inokülasyon miktarı farmakope yöntemleri ile aynı ve KoKo Test metodundaki her inokülasyon miktarından fazladır.

Kabul kriterleri açısından değerlendirildiğinde en katı kriterlerin Schülke KoKo Test metodunda olduğu görülmektedir. ISO 11930 metodunun kabul kriterleri ile Ph. Eur. 7 metodunun çok benzerdir.

Bütün bu benzerlik ve farklılıklar değerlendirildiğinde test süresinin uzun olması ve inokülasyon sayısının fazla olması nedeniyle Schülke KoKo Test metodu en az tercih edilendir. Ph. Eur. 7 ve ISO 11930 yöntemleri çok benzer olmasına karşın farmakope yöntemleri kozmetiklere özel olmadığı için ve E.coli opsiyonel olduğu için, ISO 11930 yöntemi kozmetik ürünlerde en tercih edilen yöntemdir.

Kim.Gökçe Yirmibeş

Pim Grup Proje Uzmanı

Kim.Gamze Hatun Başar

Pim Grup Ruhsatlandırma Uzmanı